Mouse IgG(Total) ELISA KIT
品牌：Solarbio | 货号：SEKM-0098
中文名称
小鼠免疫球蛋白G（总量）检测试剂盒
英文名称
Mouse IgG(Total) ELISA KIT
反应性
Mouse
样品类型
Serum, plasma, Cell culture supernatant
灵敏度
0.08 ng/ml
检测目标
IgG(Total)
应用
Sandwich ELISA
背景介绍：
 免疫球蛋白 G（IgG）是血清中免疫球蛋白主成分，约占血清中免疫球蛋白总含量的 75%， 正常值为 9.5-12.5mg/ml。其中 40-50%分布于血清中，其余分布在组织中。分子量约为 150000 道尔顿。IgG 分子的基本结构是对称的四条多肽链，即两条相同的轻链(L 链)和两条相同的 重链(H 链)，借链间二硫键连结而成"Y"字型单体分子。小鼠 IgG 主要分为以下亚型：gG1,IgG2a,IgG2b,IgG3,IgG4。IgG 分子不同类别是由各自重链的结构决定的。重链分为γ 、 μ 、α 、δ 及ε 链五类，又可按重链抗原性的不同分为若干亚类。五类 IgG 分子的轻链都相 同，可分为κ 型和λ 型，两型间的氨基酸和抗原性不尽相同，IgG 分子具有结合抗原和刺激 抗体生成的双重功能，它与抗原结合后，产生多种生物效应，包括:①与病原微生物或它分 泌的毒素结合，产生抗感染免疫;②活化体液的一类正常组分，即补体分子，起到杀伤病原 体或靶细胞的作用;③加强吞噬细胞等免疫细胞的吞噬或杀伤效应;④与组织中的肥大细胞 或嗜碱性粒细胞结合，产生过敏反应。 

检测原理：
 Solarbio (Solarbio ®)ELISA 试剂盒采用基于双抗体夹心法的酶联免疫吸附检测技术。将 抗小鼠 IgG 单克隆抗体包被在酶标板上；分别加入梯度稀释的标准品和预稀释的样本，标 准品和样本中的小鼠 IgG 会与酶标板上的包被抗体充分结合；洗板后加入生物素化抗小鼠 IgG 抗体，该抗体会与板子上包被抗体捕获的标准品和样本中的小鼠 IgG 发生特异性结合； 洗板后加入辣根过氧化物酶（HRP）标记的链霉亲和素，生物素与链霉亲和素会发生高强度 的非共价结合；洗板后加入显色剂底物 TMB，若反应孔中样品存在不同浓度的小鼠 IgG， 则 HRP 会使无色 TMB 变成不同深浅（正相关）的蓝色物质，加入终止液后反应孔会变成 黄色；最后，在 λmax=450nm（OD=450 nm）处测定反应孔样品吸光度（OD），样本中的小 鼠 IgG 浓度与 OD 成正比，通过绘制标准曲线和四参数拟合软件便可计算出样本中小鼠 IgG 的浓度。

注意事项：※※※
 1. 试剂盒应在有效期内使用，请不要使用过期的试剂。 
2. 试剂盒未使用时应保存在 2-8℃冰箱，已复溶但未用完的标准品，请丢弃。 
3. 试剂盒使用前请在室温恢复 30min，且充分混匀试剂盒里的各种成份及制备的样品。 
4. 在试验中标准品和样本建议作复孔检测，且加入试剂的顺序应保持一致。 
5. 为避免交叉污染，请在试验中使用 1 次性试管，枪头，封板膜（※）及洁净塑料容器。. 
6. 浓缩生物素化抗体和浓缩酶结合物的体积较少，在运输过程中微量液体会沾到管壁及瓶 盖上，使用前请离心处理（5-10 S 即可），使管壁上的液体集中在管底部，取用时，请 用移液器小心吹打几次。 
7. 除了试剂盒中的浓缩洗涤液和终止液可以通用外，请不要使用其他来源试剂盒内含的试 剂代替本试剂盒中的某单个组分。 8. 为保证结果准确，每次检测均需做标准曲线。 

安全提示：试剂盒中的终止液为酸性溶液，操作人员在使用时请带上手套并注意防护；在操 作过程中也要避免试剂接触皮肤和眼睛，如果不慎接触，请用大量清水清洗；检测血液样本 及其它体液样本时，请按国家生物实验室安全防护有关管理规定执行



自备实验器材（不提供，可代购）
1． 酶标仪（主波长 450nm，参考波长 630nm）
2． 高精度移液器及一次性吸头：0.5-10,2-20,20-200,200-1000μl
3． 洗板机或洗瓶
4． 37℃孵育箱
5． 双蒸水，去离子水，量筒等
6． 稀释用聚丙烯试管
7． 微量振荡器
样本收集及储存：
1. 细胞培养上清：
将细胞培养基移至无菌离心管，在 4℃条件下 1000×g 离心 10 min,然后将上清等量分装于小 EP 管并于-20℃下保存（24 小时内检测可放入 2-8℃储存），避免反复冻融。
2. 血清样本：
室温血液自然凝固 20 min 后，在 4℃条件下 1000×g 离心 10 min，然后将上清等量分装于小 EP 管并于-20℃下保存（24 小时内检测可放入 2-8℃储存），保存过程中如有沉淀，请再次离心，避免反复冻融。
3. 血浆样本：
将全血收集到含抗血凝剂的管中，根据标本的实际要求选择 EDTA，柠檬酸钠或肝素作为抗凝剂，混合 20 min，在 4℃条件下 1000×g 离心 10 min，然后将上清等量分装于小EP 管并于-20℃下保存（24 小时内检测可放入 2-8℃储存），避免反复冻融。
※注意：血清血浆样本避免使用溶血、高血脂样本，以免影响检测结果；如果样本中的靶标物检测浓度高于标准品的最高值，请将样品做适当倍数稀释后检测，建议正式实验前做预实验以确定稀释倍数。
试剂准备：
1. 试剂回温：首先在实验前 30 min 将试剂盒，待测样本放置于室温下，浓缩洗涤液如出现结晶，请放入 37℃温浴直到结晶全部溶解。
2. 配制洗涤液：预先计算好稀释后的洗涤液使用体积，然后用双蒸水或去离子水将 20 倍浓缩洗涤液稀释成 1 倍应用液，未用完的浓缩洗涤液放入 4℃冰箱保存。
3. 标准品梯度稀释：加入标准品/样本稀释液（SR1）1ml至冻干标准品中，静置15分钟待其完全溶解后轻轻混匀(浓度为10ng/ml)，然后按照以下浓度：10、5、2.5、1.25、0.625、0.313、0.156ng/ml进行稀释，标准品/样本稀释液（SR1）（0 ng/ml）作为空白孔。复溶过的标准品原液（10ng/ml）未用完的应废弃或根据需要按照一次用量分装，并将其贮存在-20～-80℃冰箱，具体如下图。



4. 生物素化抗体工作液：预先计算好试验所需用量，用检测稀释液（SR2）将30倍抗体浓缩液稀释成1倍应用工作液（稀释前充分混匀），请在30分钟内加入到反应孔中。




5. 酶结合物工作液：按每次试验所需用量配制，用酶结合物稀释液（SR3）将30倍浓缩酶结合物稀释成1倍应用工作液（稀释前离心），请在30分钟内使用。




6. 洗涤方法：
 自动洗板：甩尽酶标板孔中液体，在厚迭吸水纸上拍干，注入洗涤液为 300ul/孔,注与吸出间隔为 30 秒，洗板 5 次。
 手工洗板：甩尽酶标板孔中液体，在厚迭吸水纸上拍干，用洗瓶加入洗涤液300ul/孔，静止 30 秒后甩净酶标板孔中液体，在厚迭的吸水纸上拍干，洗板 5 次。


结果判断：
1.用酶标仪 450 nm 波长测定 OD 值。选择双波长检测，参考波长为 630 nm。如不能进行双波长检测，请用 450 nm 的 OD 测定值减去 630 nm 的 OD 测定值。
2.计算标准品、样品的平均 OD 值：每个标准品和标本的 OD 值应减去零孔的 OD 值
3.以标准品浓度为横坐标，吸光度OD值为纵坐标，用软件绘制标准曲线，样品中IgG含量可通过对应OD值由标准曲线换算出相应的浓度。
4.若标本 OD 值高于标准曲线上限，应做适当稀释后重新检测，计算浓度时再乘以稀释倍数。
参数表征：


2. 灵敏度：
最低可检测小鼠 IgG 浓度达 0.078ng/ml，20 个零标准品浓度 OD 的平均值加上两个标准差，计算相应的可检测浓度。
3. 特异性：
不与小鼠 IL-2、3、4、5、6、7、9、10Ra 反应，人 IgG 等反应
4. 重复性：
板内，板间变异系数<10%
5. 回收率：
在选取的健康小鼠血浆、细胞培养上清中加入 3 个不同浓度水平的小鼠 IgG，计算回收率。



6. 线性稀释：
分别在选取的 4 份健康小鼠血浆和细胞培养上清中加入高浓度小鼠 IgG，在标准曲线动力学范围内进行稀释，评估线性